慢病毒载体（Lentivirus vectors）的特性：在非分裂和分裂细胞中稳定整合、转基因的长期表达、低免疫原性，使其成为基因治疗的理想基因转移载体。转基因可以在非分裂或终末分化的非常静止的细胞（例如神经元）中实现。我们的慢病毒载体来源于HIV-1病毒，序列经过精心优化，提高了生物安全性、基因表达水平和病毒转导效率。慢病毒颗粒通常是在包装细胞中共表达病毒体包装元件和载体基因组来产生的。我们开发出了一系列专有技术和试剂，从病毒滴度、纯度、活性以及一致性等方面提升了慢病毒包装工艺水平。除了科研级别的慢病毒外，我们还提供GMP级别的慢病毒制备服务。
| 生产规格 | 总量 | 最小滴度 | 分装 | 价格（CNY） | 周期 |
| 慢病毒小量制备 | >2.5x107 TU | >108 TU/ml | 10x25 ul | ￥3,180.00 | 6-12天 |
| 慢病毒中量制备 | >108 TU | >108 TU/ml | 10x100 ul | ￥4,680.00 | |
| 慢病毒大量制备 | >109 TU | >109 TU/ml | 10x100 ul | ￥7,780.00 | |
| 超纯化慢病毒中量制备 | >5x108 TU | >109 TU/ml | 10x50 ul | ￥9,780.00 | |
| 超纯化慢病毒大量制备 | >109 TU | >109 TU/ml | 10x100 ul | ￥11,880.00 |
| 生产规格 | 总量 | 最小滴度 | 分装 | 价格（CNY） | 周期 |
| 二代慢病毒小量制备 | >2.5x107 TU | >108 TU/ml | 10x25 ul | ￥3,180.00 | 6-12天 |
| 二代慢病毒中量制备 | >108 TU | >108 TU/ml | 10x100 ul | ￥4,680.00 | |
| 二代慢病毒大量制备 | >109 TU | >109 TU/ml | 10x100 ul | ￥7,780.00 | |
| 超纯化二代慢病毒中量制备 | >5x108 TU | >109 TU/ml | 10x50 ul | ￥9,780.00 | |
| 超纯化二代慢病毒大量制备 | >109 TU | >109 TU/ml | 10x100 ul | ￥11,880.00 |
| 生产规格 | 总量 | 最小滴度 | 分装 | 价格（CNY） | 周期 |
|---|---|---|---|---|---|
| 非整合型慢病毒小量制备 | >2.5x107 TU | >108 TU/ml | 10x25 ul | ￥3,180.00 | 6-12天 |
| 非整合型慢病毒中量制备 | >108 TU | >108 TU/ml | 10x100 ul | ￥4,680.00 | |
| 非整合型慢病毒大量制备 | >109 TU | >109 TU/ml | 10x100 ul | ￥7,780.00 | |
| 超纯化非整合型慢病毒中量制备 | >5x108 TU | >109 TU/ml | 10x50 ul | ￥9,780.00 | |
| 超纯化非整合型慢病毒大量制备 | >109 TU | >109 TU/ml | 10x100 ul | ￥11,880.00 |
| 非纯化慢病毒制备服务 | 纯化慢病毒制备服务 | |
| 交付内容 | 定制病毒，按照规格交付：
| 定制病毒，按照规格交付：
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对照病毒，按照定制病毒的规格对应赠送：
| 对照病毒，按照定制病毒的规格对应选购：
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| Polybrene（5 mg/ml，200 ul），赠送 | Polybrene（5 mg/ml，200 ul），赠送 | |
辅助病毒，按照定制病毒的规格对应选购：
| 辅助病毒，按照定制病毒的规格对应选购：
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| 病毒重悬液 | HBSS缓冲液 | HBSS缓冲液 |
| 运输/存储 | 干冰/-80°C，避免反复冻融 | 干冰/-80°C，避免反复冻融 |
| 推荐应用 | 体外培养细胞转导 | 体外培养细胞转导、动物体内细胞转导 |
对照病毒
为了更好地开展您的实验，我们按照“对照病毒与定制病毒的生物学应用相匹配”的原则给您赠送或者推荐对照病毒。例如，如果定制病毒表达一个基因，则推荐的对照病毒表达荧光蛋白EGFP。如果定制病毒表达打靶某个基因的shRNA，则对照病毒表达一个Scramble shRNA。推荐的对照病毒信息如下表所示：
| 对照病毒 | 对照载体名称 | 对照载体ID | 定制病毒 |
| EGFP对照慢病毒，EGFP/mCherry双荧光，Puro抗性 | pLV[Exp]-EGFP:T2A:Puro-EF1A>mCherry | VB010000-9298rtf | 哺乳动物基因表达慢病毒（包含Tet-On诱导表达和FLEX条件性表达）、哺乳动物CRISPR慢病毒、哺乳动物非编码RNA表达慢病毒 |
| Scramble shRNA对照慢病毒，EGFP荧光，Puro抗性 | pLV[shRNA]-EGFP/Puro-U6>Scramble_shRNA | VB010000-0009mxc | 哺乳动物shRNA干扰慢病毒 |
| Scramble miR30-shRNA对照慢病毒，EGFP/mCherry双荧光，Puro抗性 | pLV[miR30]-EGFP/Puro-EF1A>mCherry:Scramble_miR30-shRNA | VB010000-9387zjj | 哺乳动物miR30-shRNA干扰慢病毒 |
| TRE-mCherry对照慢病毒，EGFP/mCherry双荧光，Puro抗性（选购） | pLV[TetOn]-EGFP/Puro-TRE>mCherry | VB010000-9449ujz | 哺乳动物基因Tet-On诱导表达TRE慢病毒 |
| FLEX-mCherry对照慢病毒，EGFP/mCherry双荧光，Puro抗性（选购） | pLV[FLEXon]-EGFP/Puro-EF1A>LL:rev(mCherry):rev(LL) | VB010000-9324qqg | 哺乳动物基因FLEX条件性表达慢病毒 |
辅助病毒
为了更好地开展您的实验，我们按照“辅助病毒与定制病毒的生物学应用相匹配”的原则给您推荐辅助病毒。例如，如果定制病毒是一个只含TRE启动子的TetOn慢病毒，则需要一个表达rtTA的辅助病毒，才能进行诱导表达实验。推荐的辅助病毒信息如下表所示：
| 辅助病毒 | 辅助载体名称 | 辅助载体ID | 定制病毒 |
| Cas9慢病毒，Hygro抗性（选购） | pLV[Exp]-CBh>hCas9/Hygro | VB010000-9380sne | 哺乳动物gRNA慢病毒（不含Cas9） |
MS2/P65/HSF1慢病毒（dCas9-SAM系统元件之一），Hygro抗性（选购） 注意：该ORF序列存在特殊结构，使用其生产的慢病毒的滴度有可能会比同规格慢病毒的保证滴度低1-10倍。 | pLV[Exp]-EF1A>MS2/P65/HSF1/Hygro | VB010000-9383ffr | 哺乳动物msgRNA表达慢病毒（dCas9-SAM系统元件之一） |
| dCas9/VP64慢病毒（dCas9-SAM系统元件之一），Bsd抗性（选购） | pLV[Exp]-EF1A>dCas9/VP64/Bsd | VB010000-9384wwc | 哺乳动物msgRNA表达慢病毒（dCas9-SAM系统元件之一） |
| Cre慢病毒，Hygro抗性（选购） | pLV[Exp]-CMV>Cre/Hygro | VB010000-9372bck | 哺乳动物基因FLEX条件性表达慢病毒 |
| tTS/rtTA慢病毒，Hygro抗性（选购） | pLV[Exp]-CMV>tTS/rtTA/Hygro | VB010000-9369xhm | 哺乳动物基因Tet-On诱导表达TRE慢病毒 |
我们的慢病毒存储在HBSS缓冲液中，并采用干冰运输。收到慢病毒后，立即放置于-80℃，长期贮存至少6个月。慢病毒的保质期约为一年。请避免反复冻融，因为这会导致慢病毒滴度大幅下降。
| 步骤 | 描述 | 时间 |
Co-transfection | 我们常规使用的第三代慢病毒包装系统包括1个转移质粒（Transfer plasmid）、1个膜蛋白表达质粒（Envelope plasmid）、2个包装质粒（Packaging plasmids），将这些质粒共转染包装细胞。2个包装质粒分别为Gag/Pol表达质粒和Rev表达质粒。 | 第1天 |
Supernatant collection | 在细胞里，转移质粒转录出携带目的基因（Gene of Interest，简称GOI）的HIV RNA基因组，与包装质粒表达出的衣壳结构蛋白、酶、调控蛋白组装成病毒颗粒后，转运到细胞膜内侧，形成包膜病毒分泌到胞外。膜蛋白质粒表达的VSV-G膜蛋白锚定在细胞膜上，随着病毒成熟，与细胞膜一起成为了病毒的膜。细胞短暂孵育后，收集上清，离心去除细胞碎片并过滤。 | 第3天 |
Concentration and purification | PEG浓缩病毒颗粒。对于超纯化慢病毒（体内应用级别），采用蔗糖离心方法进一步纯化、浓缩病毒。 | 第4天 |
Quality Control | 对病毒进行滴度测定（Titer determination）、微生物检测（Bioburden test，针对细菌、真菌）、支原体检测（Mycoplasma test）等。 若转移载体同时编码一个荧光蛋白，我们还会将病毒进行细胞转导以测定相应的荧光表达情况（Transduction test）。此外，对于超纯化慢病毒，我们还可以检测内毒素水平（Endotoxin test）。 | 第5天及以后 |
注意：第三代慢病毒包装系统只能包装第三代的慢病毒转移载体。但是第二代慢病毒包装系统既能包装第二代，也能包装第三代的慢病毒转移载体。第三代慢病毒转移载体上的5’ LTR中的U3元件是被一个外源启动子替代（如CMV启动子或者RSV启动子），使其不依赖Tat蛋白进行HIV RNA基因组的转录，故第三代慢病毒包装系统的包装质粒不含Tat蛋白。第二代慢病毒转移载体上的5’ LTR是野生型的LTR，含有U3、R和U5元件，依赖Tat蛋白转录HIV RNA基因组，故第二代慢病毒包装系统的包装质粒含有Tat蛋白。
我们的滴度保证仅适用于这样的转移载体
对于如下这样的转移载体，我们不能保证滴度：
交付周期是指订单接收到发货之间的时间，不包括需要客户提供任何物料（如病毒载体）的等待时间。对于不含有荧光标记，但是含有药筛标记的病毒载体，如果您需要获得细胞药筛效果的质检结果，由于细胞生长状态需要较长时间观察，周期将额外增加8-10天。
如需客户提供慢病毒载体，则请按照外来物品接收指南将载体寄送给我们。请严格按照我们的指南来进行装运以免造成物品的任何延误和损坏。客户提供的所有材料均需经过QC检测，每一份材料附加检测费用。请注意，客户提供物品接收并通过QC之后生产才正式开始。
慢病毒转导
使用说明书
慢病毒体外应用慢病毒载体系统经历了至少三代演变发展，随着代次更新，生物安全性逐步提高。第一代系统（1st generation）虽然使用了三质粒系统，但是仍保留了大部分HIV基因组，安全性欠佳，现已基本淘汰。相比第一代系统，第二代系统（2nd generation）剔除了与病毒复制相关的Vif、Vpr、Nef等辅助基因，仅保留了与病毒转录、组装相关的Gag、Pol、Tat和Rev基因。值得注意的是，第二代系统的转移载体是使用野生型 5‘ LTR启动子转录HIV RNA转录本的。野生型 5‘ LTR启动子依赖Tat蛋白的结合才能激活其转录活性，所以第二代慢病毒的包装必须使用第二代系统的包装质粒，因为它能表达Tat蛋白。
第三代系统（3rd generation）在第二代基础上做了这些改进：
1. 包装质粒被拆分成两个，分别表达Rev和Gal/Pol，进一步降低了包装质粒和转移载体在包装过程中产生DNA重组的几率，从而降低形成复制型病毒的风险；
2. 包装质粒上Tat基因被去除，进一步降低致癌的风险（Nunnari G 2008)。而转移载体上的野生型5’ LTR元件改造成Hybrid 5' LTR，删除了U3区域，并融合了强启动子，如CMV或者RSV启动子，可以不依赖Tat转录HIV RNA；
3. 3’ LTR的U3区域被删除，不能将完整的3‘ LTR复制到5' LTR上，原病毒DNA就不能自我转录生成新的病毒RNA，具有这个特征的病毒被称为自我失活型（Self inactivation，简称SIN）。第三代系统需要转染四个质粒（1个转移载体、2个包装质粒、1个包膜蛋白表达质粒），对生产技术要求更高一些。第二代慢病毒包装质粒可以包装第二、第三代的转移载体，而第三代慢病毒包装质粒系统缺少Tat，不能包装第二代转移载体。
| 慢病毒 | MMLV | 腺病毒 | AAV | |
| 组织嗜性 | 广泛 | 广泛 | hAd5只感染表达CAR受体的细胞 | 取决于血清型 |
| 是否可感染非分裂细胞 | 是 | 否 | 是 | 是 |
| 病毒基因组稳定整合抑或游离于宿主基因组 | 稳定整合 | 稳定整合 | 游离的DNA附加体形式 | 游离的DNA附加体形式 |
| 自定义启动子 | 是 | 否 | 是 | 是 |
| 应用 | 细胞培养和体内实验 | 细胞培养和体内实验 | 体内实验 | 体内实验 |
| 体内免疫反应 | 低 | 低 | 高 | 非常低 |
我们使用p24 ELISA法测定慢病毒滴度。该方法的三明治免疫试验可测定HIV-1 核心蛋白p24在慢病毒上清液中的含量水平。我们首先在微量滴定板上加入慢病毒样本，然后每孔加入HIV-1 p24捕获抗体进行孵育，并随后添加生物素化的p24二抗以结合p24一抗。此后，样本中加入的辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素可特异性结合生物素化的p24二抗。在最后一步中，加入辣根过氧化物酶底物反应液，经HRP催化产生有颜色的产物。每个孔的颜色深度最终反映了慢病毒样本中的p24含量。使用分光光度计测量的样本吸光度数值与重组HIV-1的 p24标准曲线进行对照，然后被换算为对应的慢病毒滴度。
野生型慢病毒HIV-1的基因组长度约为9.2 kb，这也是重组慢病毒载体的承载限度范围。载体上能包装进病毒的区域长度为从5’ LTR的R元件的第一个碱基到3’ LTR的R元件的最后一个碱基。超出承载量的片段插入则会造成病毒包装滴度降低。
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