预设计的CRISPR文库

双gRNA文库要比单gRNA文库强大的多，这是由于双gRNA文库引入的大片段缺失在产生基因功能缺失上更高效。每个慢病毒载体含有一对gRNA表达盒子，这对gRNA打靶同一个基因。导入Cas9蛋白表达细胞后，每个载体能够在一个基因上产生两个切口。细胞修复这两个切口的时候，往往倾向发生两个切口之间的大片段缺失。这两个切口通常被设计在目的基因的重要区域上，当两个切口之间的片段缺失后，目的基因的功能也会丧失。

对于典型的敲除筛选实验，CRISPR文库构建可以采用单载体或双载体系统。在单载体系统中，Cas9或Cas9变体与来自同一载体且与gRNA共表达，而在双载体系统中，Cas9或Cas9变体和gRNA由两个单独的载体表达。此外，在双载体系统中，可以将表达gRNA的载体引入稳定表达Cas9的细胞系中。使用单载体系统的优点是它无需将两种不同载体共转染/转导到细胞中，并且不要求使用表达Cas9的稳定细胞系。然而，与双载体系统相比，它的通用性较差，并且在载体克隆和病毒包装方面的效率较低。

我们使用的gRNA设计和评分使用了 CRISPR文库设计（CLD）中的规则。简而言之，对于每个物种，我们找出符合N(20)NGG规则的靶序列，把错配碱基 ≤3的序列列为潜在的脱靶位点，计算出每个gRNA的脱靶分值，进而得出最终的gRNA特异性分值。gRNA特异性分值在0-100之间，分值越大靶向特异性越高。

请注意特异性分值只是一个参考值。实际的靶向效率和特异性可能会与预测的分值有偏差，低分值的gRNA也可能有较好的靶向效果。